54827-17-7 / TMB顯色液_使用說(shuō)明書(shū)

TMB顯色液是一種采用了最新單一溶液TMB顯色技術(shù)，通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化TMB顯色，用于ELISA等的顯色液。本顯色液也可以用于檢測(cè)血液或血紅蛋白等樣品中的過(guò)氧化物酶含量。

通常的TMB顯色試劑由多個(gè)組份組成，必須在使用前進(jìn)行配制，并且容易產(chǎn)生沉淀，使用相對(duì)不太方
便，并且也容易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不太穩(wěn)定。本TMB顯色液采用了最新的TMB顯色技術(shù)，把所有的相關(guān)試劑全部配制在一個(gè)溶液中，僅由單一溶液組成，簡(jiǎn)化了操作步驟，并且使檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。

TMB，即3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，是辣根過(guò)氧化物酶的常用底物。在辣根過(guò)氧化物酶或其他適當(dāng)過(guò)氧化物酶的催化下，TMB會(huì)產(chǎn)生可溶性藍(lán)色產(chǎn)物。藍(lán)色產(chǎn)物通?？梢栽?70nm或620-650nm測(cè)定吸光度。
辣根過(guò)氧化物酶催化TMB顯藍(lán)色后可以使用2M H2SO4終止反應(yīng)。加入硫酸后，溶液呈黃色，此時(shí)可以在450nm測(cè)定吸光度。

圖1為T(mén)MB顯色反應(yīng)

背景知識(shí)
目前酶免疫分析（EIA)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于抗原，半抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)分析。辣根過(guò)氧化物酶（HRP)及其偶聯(lián)物是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)中常用的一種酶，由于3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB)在HRP的顯色反應(yīng)體系中，比其它色原具有更高的靈敏度且無(wú)致癌性而被廣泛應(yīng)用。TMB主要應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)，免疫斑點(diǎn)雜交或者免疫組化以及氯和過(guò)氧化氫的檢測(cè)分析。為了滿(mǎn)足不同的試劑盒產(chǎn)品研發(fā)與生產(chǎn)以及科研需求，本公司專(zhuān)門(mén)研制了針對(duì)不同類(lèi)型的基于HRP的免疫分析用TMB顯色液。

產(chǎn)品特點(diǎn)

• 即用型：無(wú)需混合，方便快捷，減少誤差
• 靈敏度高：不低于A、B液
• 穩(wěn)定性好：2-8℃保存，有效期不低于36個(gè)月；顯色終止后讀數(shù)穩(wěn)定
• 背景低：底物溶液在650nm檢測(cè)時(shí)檢測(cè)OD值小于0.04
• 質(zhì)量可靠：產(chǎn)品批間差異小
• 外觀：本試劑一般情況下為無(wú)色，有時(shí)略顯淺藍(lán)色或淺黃色

使用方法
用適當(dāng)?shù)母蓛羧萜鳎ㄓ眉儍羲磸?fù)沖洗），倒出適量的單組分TMB顯色液，待達(dá)到室溫后即可使用。
加液：加完HRP結(jié)合物并孵育一定時(shí)間后，用適當(dāng)洗滌液洗板3-5次，每孔加TMB顯色液100ul。 根據(jù)個(gè)人實(shí)驗(yàn)需要，在室溫（15-25℃）或37℃下避光溫育10-30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，直至顯色至預(yù)期深淺。
終止：加入等體積的1M 鹽酸或硫酸溶液終止反應(yīng)，孔中反應(yīng)液由藍(lán)色變?yōu)辄S色。
讀數(shù)：終止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)在450nm處測(cè)定吸光值。
注意：如果出現(xiàn)高的反應(yīng)背景或沉淀，表明TMB底物反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈。為了避免產(chǎn)生沉淀，可在終止后馬上讀數(shù)；或者進(jìn)一步稀釋一抗和/或HRP結(jié)合物。

使用說(shuō)明
1. 對(duì)于ELSIA檢測(cè)：

1. 參考ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟，在與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體孵育后，用適當(dāng)洗滌液洗滌3-5次，每次3-5分鐘。
2. 洗滌完畢后，去除洗滌液，加入200微升TMB顯色液。
3. 室溫避光孵育3-30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可長(zhǎng)達(dá)24小時(shí))，直至顯色至預(yù)期深淺。
4. 直接在370nm或620-650nm測(cè)定吸光度。或加入50微升2M H2SO4終止反應(yīng)，隨后在450nm測(cè)定吸光度。

2. 對(duì)于在96孔板內(nèi)進(jìn)行的其他適當(dāng)檢測(cè) (例如檢測(cè)組織或細(xì)胞樣品內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶)：

1. 直接在96孔板內(nèi)每孔加入10-20微升樣品。
2. 加入200微升TMB顯色液。
3. 室溫避光孵育3-30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可長(zhǎng)達(dá)24小時(shí))，直至顯色至預(yù)期深淺。
4. 直接在370nm或620-650nm測(cè)定吸光度?；蚣尤?0微升2M H2SO4終止反應(yīng)，隨后在450nm測(cè)定吸光 度。

常見(jiàn)問(wèn)題
1. 背景顯色太深。

• 如果背景(沒(méi)有樣品的對(duì)照)顯色太深，一方面需考慮使用適當(dāng)?shù)姆忾]液進(jìn)行封閉，例如選購(gòu)適當(dāng)?shù)姆忾]液或使用和一抗相同來(lái)源的血清(10%)進(jìn)行封閉。另一方面，請(qǐng)選購(gòu)經(jīng)過(guò)適當(dāng)吸附的二抗，以減小二抗的非特異性吸附。
• 可以考慮縮短顯色時(shí)間，或降低二抗?jié)舛取Ａ硗?，選擇適當(dāng)強(qiáng)度的洗滌液，或延長(zhǎng)洗滌時(shí)間也會(huì)有所幫助。

2. 沒(méi)有顯色或顯色太弱。

• 適當(dāng)提高一抗或二抗的濃度。檢測(cè)二抗效果，滴一滴稀釋二抗在離心管內(nèi)，檢測(cè)二抗是否可以被正常顯色。
• 可以考慮使用更加靈敏的放大檢測(cè)體系，例如使用生物素檢測(cè)體系。
• 可以適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間。
• 如果上述改進(jìn)不能獲得預(yù)期效果，可以考慮更換效果更好的一抗或ELISA試劑盒。