諾如病毒GI/GII型雙重探針法qRT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
諾如病毒（Norovirus）又稱諾瓦克病毒（Norwalk Virus，NV）屬于人類杯狀病毒屬，是無包膜單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約7500-7700 nt，是一種引起非細(xì)菌性急性腸胃炎的病毒。諾如病毒分為G（I-V）五型，其中引起人類感染的主要是 GⅠ和GⅡ。主要通過口-糞傳播，容易在人群中引起暴發(fā)流行。感染后癥狀有嘔吐、腹瀉、腹痛，發(fā)熱、頭痛等。美國(guó)每年在所有的非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)中，60-90%是由諾如病毒引起。荷蘭、英國(guó)、日本澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)家也都有類似結(jié)果。在中國(guó)5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢出率為15%左右，調(diào)查表明中國(guó)人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。給人類的健康造成巨大危害，因此快速檢測(cè)諾如病毒GI/GII型具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的對(duì)諾如病毒GI和GII型的分型檢測(cè)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物和探針分別根據(jù)諾如病毒GI和GII型RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
6. 兩個(gè)探針分別用FAM和Cy5標(biāo)記，檢測(cè)和分型同時(shí)完成。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20 mL體系的探針法RT-PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分
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規(guī)格
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包裝
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探針法qRT-PCR緩沖液
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0.5mL
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0.5mL本色管
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探針法qRT-PCR酶混合液v2
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1mL
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1.5mL綠蓋管
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熒光PCR專用模板稀釋液
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1mL
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1.5mL藍(lán)蓋管
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諾如病毒GI/GII型RT-PCR引物-探針干粉
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50次
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0.5mL棕色管
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諾如病毒GI型陽性對(duì)照(1E7拷貝/mL)
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50μL
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0.5mL黃蓋管
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諾如病毒GII型陽性對(duì)照(1E7拷貝/mL)
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50μL
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0.5mL白蓋管
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使用手冊(cè)
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1份
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無
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本產(chǎn)品使用十一孔盒包裝
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220μL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。本試劑盒采用DNA作為陽性對(duì)照。不能有效監(jiān)控核酸純化和RT過程。如果需要RNA模板，需要另外定做。
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使用方法
稀釋諾如病毒GI型檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品陽性對(duì)照1E1-1E6拷貝/mL這6個(gè)10倍稀釋度
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為A6、A5、A4、A3、A2、A1。
2. 在A1-A6號(hào)管中各加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在A6號(hào)管中加入5μL1E7拷貝/μL的陽性對(duì)照（試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線PC樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在A5號(hào)管中加入5μL 1E6拷貝/μL的陽性對(duì)照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在A4號(hào)管中加入5μL1E5拷貝/μL的陽性對(duì)照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作得到A1-A6共六個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性樣品。放冰上待用。
稀釋諾如病毒GII型檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
7. 操作同上，只是使用諾如病毒GII型的PC作為模板。得到6個(gè)濃度的樣本放冰上待用，分別是B1-B6。
樣品RNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+3個(gè)提取，多出的一個(gè)是諾如病毒GI型的PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是諾如病毒GII型的PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10 μL第一步和第二步所得的4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此分別作為兩個(gè)PC。另外用水作為NC，水的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。
注 意：本試劑盒采用DNA作為陽性對(duì)照，不能有效監(jiān)控核酸純化和RT過程。如果需要RNA模板，需要另外定做。
9. 用自選方法純化樣品的RNA。本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應(yīng)20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+1+6+6個(gè)RT-PCR管，其中N+3個(gè)用于上步得到的N+3個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于諾如病毒GI型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外6個(gè)用于諾如病毒GII型的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+3個(gè)RT-PCR管，其中N+3個(gè)用于上步得到的N+3個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于諾如病毒GI型RT-PCR陽性對(duì)照，1個(gè)用于諾如病毒GII型RT-PCR陽性對(duì)照（直接用第一步和第二步所得的兩個(gè)4號(hào)稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽性對(duì)照或制備陽性對(duì)照結(jié)果為陰性，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購(gòu)買新的引物和探針。
2. 如果陰性對(duì)照和陽性對(duì)照正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 對(duì)定量檢測(cè)，以標(biāo)曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以諾如病毒GI型陽性對(duì)照（FAM通道）和諾如病毒GII型陽性對(duì)照（Cy5通道）的Ct值為縱軸，繪制兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，r2必須大于0.95。再以待測(cè)樣品的Ct值從分別從兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出對(duì)應(yīng)樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 對(duì)定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照FAM通道的熒光信號(hào)必須有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為諾如病毒GI型陰性，如果小于或等于35則為諾如病毒GI型陽性。如果其Cy5通道的Ct大于或等于40則為諾如病毒GII型陰性，如果小于或等于35則為諾如病毒GII型陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
自備試劑
樣品RNA，超純水
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
