ELISA外源性干擾物質(zhì)會(huì)影響抗體和抗原結(jié)合,導(dǎo)致分析物濃度假高或假低,從而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。這些干擾物質(zhì)非目標(biāo)分析物,可能來(lái)自各種外源,例如樣品處理不當(dāng),或存在于患者血液中,例如脂質(zhì)、膽紅素或血紅蛋白。了解這些干擾因素對(duì)于準(zhǔn)確的診斷和治療至關(guān)重要。
標(biāo)本溶血
血紅蛋白中的血紅素基因有類(lèi)似過(guò)氧化的活性,如果以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)為標(biāo)記酶的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)中,如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高,其在溫育過(guò)程就會(huì)被吸附在固相,從而在后面加入的HRP和底物反應(yīng)顯色和發(fā)光,導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
如何避免這種影響
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保證樣本質(zhì)量:這是最重要的一步。在采集和處理血液樣本時(shí),要盡量輕柔,避免劇烈震蕩或反復(fù)凍融,以防止溶血。離心得到的血清或血漿應(yīng)該是清澈淡黃色的,而不是粉紅色或紅色。
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充分洗滌:ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗滌步驟至關(guān)重要。充分的洗滌可以洗掉未結(jié)合的物質(zhì),包括那些非特異性吸附在孔板上的血紅蛋白,從而降低背景信號(hào)。
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設(shè)置合適的對(duì)照:設(shè)置不加一抗或二抗的空白對(duì)照孔,如果這些孔也出現(xiàn)了明顯的顏色,則很可能是由樣本中的內(nèi)源性類(lèi)過(guò)氧化物酶(如血紅蛋白)活性引起的。
樣本被細(xì)菌污染
如果樣本被細(xì)菌污染,這些細(xì)菌可能含有內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶/過(guò)氧化氫酶就會(huì)成為一個(gè)嚴(yán)重的干擾源,在ELISA實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生非特異性顯色,進(jìn)而干擾測(cè)定結(jié)果,造成假陽(yáng)性。
如何避免這種影響:
在加入HRP標(biāo)記的抗體之前,用3%的過(guò)氧化氫(H?O?)溶液處理樣本/固相載體(如ELISA板、IHC切片)10-15分鐘,然后用緩沖液(如PBS或PBST)徹底洗滌。
樣本保存不當(dāng)
如果樣本保存不當(dāng),血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體。在ELISA實(shí)驗(yàn)中,尤其是間接ELISA法,IgG聚合體和內(nèi)源性酶會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深,AFP二聚體會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏低。
如何避免這種影響:
樣本保存合適的溫度,避免樣本反復(fù)凍融,在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)可以做對(duì)照
標(biāo)本凝集不全
在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)中,血液還未開(kāi)始凝固時(shí)候強(qiáng)行離心分離血清,此時(shí)血清仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA檢測(cè)中容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。
如何避免這種影響:
血液樣本收集后,應(yīng)在室溫下靜置一段時(shí)間(例如30-60分鐘),待其完全凝固后,再通過(guò)離心分離上清,即可獲得血清。
樣本管中添加物質(zhì)
抗凝劑(如肝素、EDTA)、酶抑制劑(如NaN3)及快速分離血清的分離膠等均對(duì)ELISA測(cè)定有一定干擾作用。例如,肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值,EDTA、NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性,從而影響檢測(cè)結(jié)果,可能導(dǎo)致假陰性。
如何避免這種影響:
遵循說(shuō)明選對(duì)樣,規(guī)避干擾做好驗(yàn)證。
樣本中存在的內(nèi)源性及外源性干擾物質(zhì),對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有決定性影響,甚至可以使整個(gè)實(shí)驗(yàn)功虧一簣。因此,透徹理解這些干擾因素的作用機(jī)制,是避免出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性等各種錯(cuò)誤結(jié)果,確保數(shù)據(jù)真實(shí)可靠的根本前提。