實驗實驗常用的elisa試劑盒在科研中常用于測量生物樣本中抗原、抗體、肽、蛋白質(zhì)、激素或其他生物分子的存在和/或濃度。它非常靈敏，能夠檢測出低濃度的抗原。ELISA的靈敏度歸因于它能夠檢測單個抗原-抗體復(fù)合物之間的相互作用。除此之外，加入酶偶聯(lián)抗原特異性抗體可以將無色底物轉(zhuǎn)化為顯色或熒光產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以通過酶標(biāo)儀檢測和輕松定量。當(dāng)與已知抗原滴定量產(chǎn)生的值進(jìn)行比較時，可以確定實驗樣本中相同抗原的濃度。

  雖然不同的科研人員可能使用不同的ELISA試劑盒方案來測量樣本中的抗原濃度，但這些方案都基于相同的原理。選擇要執(zhí)行的ELISA類型（間接、夾心或競爭）取決于許多因素，包括要測試的樣本的復(fù)雜性和可用的抗原特異性抗體。間接ELISA常用于確定免疫反應(yīng)的結(jié)果，例如測量樣本中抗體的濃度。夾心ELISA最適合分析復(fù)雜樣本，例如組織培養(yǎng)上清液或組織裂解物，其中分析物或目標(biāo)抗原是混合樣本的一部分。最后，當(dāng)只有一種抗體可用于檢測目標(biāo)抗原時，最常使用競爭性ELISA。競爭性ELISA還可用于檢測只有一個抗體表位的小抗原，由于空間位阻，這種抗原無法容納兩種不同的抗體。接下來上海紀(jì)寧生物為大家詳細(xì)描述一下ELISA試劑盒檢測方法及實驗步驟。

  間接ELISA法及實驗步驟

  間接ELISA檢測通常用于測量血清或雜交瘤培養(yǎng)上清液中的抗體量。間接ELISA檢測的一般步驟如下：

  用抗原包被孔

  加入含有抗體（一抗或1°抗體）的血清或雜交瘤培養(yǎng)上清液

  孵育并清洗

  添加二抗（或2°）酶聯(lián)抗體

  孵育并清洗

  添加底物

  夾心ELISA法及實驗步驟

  夾心ELISA檢測不同于間接ELISA檢測，因為該方法不涉及用純化的抗原包被板。相反，使用“捕獲”抗體包被板的孔?？乖?/span>“夾”在捕獲抗體和第二個“檢測”酶偶聯(lián)抗體之間——其中兩種抗體對同一抗原具有特異性，但針對不同的表位。通過與捕獲抗體/抗原復(fù)合物結(jié)合，檢測抗體保留在板中。單克隆抗體或多克隆抗血清可用作捕獲和檢測抗體。夾心ELISA的主要優(yōu)點是分析前無需純化樣品。此外，該檢測非常靈敏。許多市售ELISA試劑盒都是夾心類型，使用經(jīng)過測試的匹配抗體對。夾心ELISA檢測的一般程序是：

  用捕獲抗體包被孔

  添加含有抗原的測試樣本

  孵育并清洗

  添加酶聯(lián)檢測抗體。

  孵育并清洗

  添加底物

  大多數(shù)市售的夾心ELISA試劑盒都配有酶偶聯(lián)檢測抗體。如果沒有酶偶聯(lián)檢測抗體，可以使用針對檢測抗體的特異性二抗。二抗上的酶起著相同的作用，即將無色底物轉(zhuǎn)化為顯色或熒光產(chǎn)物。例如，上述二抗更傾向于在由已經(jīng)生成自己的單克隆抗體的研究人員開發(fā)的“自制”夾心ELISA中使用。使用二抗的一個缺點是要確保它只與檢測抗體結(jié)合，而不是與結(jié)合到板上的捕獲抗體結(jié)合。這將導(dǎo)致所有孔中都有可測量的產(chǎn)物，無論是否存在抗原或檢測抗體。

  競爭ELISA法及實驗步驟

  最后，使用競爭性ELISA檢測可溶性抗原。該方法操作簡單，但僅適用于純化抗原量較大時。競爭性ELISA檢測的一般程序為：

  用抗原包被孔

  孵育并清洗

  將測試樣品與酶偶聯(lián)的一抗預(yù)孵育

  將混合物加入

  孵育并洗去任何未結(jié)合的酶偶聯(lián)一抗

  添加底物

  本測定中的“競爭”源自于這樣的事實：步驟3中使用的測試樣品中的抗原越多，可與孔中包被的抗原結(jié)合的抗體就越少。因此，測定結(jié)束時孔中顯色/熒光產(chǎn)物的強(qiáng)度與測試樣品中存在的抗原量成反比。

  任何類型的ELISA中的關(guān)鍵組成部分都是已知濃度的滴定標(biāo)準(zhǔn)，它使用戶能夠確定測試樣本中存在的抗原濃度。通常，會指定一系列孔來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中將已知量的純化重組蛋白以遞減的量添加到孔中。當(dāng)這些孔與測試樣本同時處理時，用戶可以從微孔板讀數(shù)器獲得一組已知蛋白質(zhì)濃度的參考吸光度值，以配合測試樣本的吸光度值。然后，用戶可以計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測試樣本與該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，以確定存在的目標(biāo)蛋白質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線還可以確定用戶稀釋的精確度。

  最后，上述每種ELISA類型的最后一步都需要添加底物。底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的程度與孔中存在的酶量直接相關(guān)。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)是與抗體結(jié)合的最常見酶。正如預(yù)期的那樣，有許多底物可用于產(chǎn)生顯色或熒光產(chǎn)物的酶。此外，底物的靈敏度范圍很廣，可以提高檢測的整體靈敏度。在選擇要使用的底物類型及其相應(yīng)的酶結(jié)合抗體時，用戶還必須考慮實驗結(jié)束時可用于讀取板的儀器類型。

  HRP常用的顯色底物包括2,2'-聯(lián)氮雙[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽(ABTS)和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，而AP則使用對硝基苯基磷酸酯(PNPP)。ABTS和TMB分別產(chǎn)生水溶性綠色和藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物。綠色ABTS產(chǎn)物有兩個主要吸光度峰，分別為410和650nm，而藍(lán)色TMB產(chǎn)物在370和652nm處檢測效果最佳。加入酸性終止液后，ABTS和TMB的顏色會變成黃色，最佳讀數(shù)為450nm。ABTS顯色速度慢，而TMB顯色速度快。TMB比ABTS更靈敏，如果酶促反應(yīng)進(jìn)行時間過長，可能會產(chǎn)生更高的背景信號。PNPP經(jīng)AP轉(zhuǎn)化后生成黃色水溶性產(chǎn)物，在405nm處吸收光。