原代細胞培養(yǎng)的注意事項

 

    （1）無菌操作：無菌操作是原代細胞培養(yǎng)成功的基石。細菌與霉菌污染占失敗案例的80%以上，需以預(yù)防為核心：操作前紫外消毒≥30分鐘+器械乙醇浸泡；取材后立即雙抗漂洗；培養(yǎng)基添加抗生素僅作臨時防護（如0.5%Primocin）。污染后難以徹底清除，因細菌生物膜、支原體穿透性及霉菌孢子抗性均可能導(dǎo)致細胞報廢，需廢棄污染樣本并徹底環(huán)境消殺。

 

    （2）培養(yǎng)基：培養(yǎng)基需滿足細胞營養(yǎng)、滲透壓（哺乳類260–320mOsm/kg）及pH（7.2–7.4）等生存條件。因物種與組織差異（如神經(jīng)元用Neurobasal+B27，昆蟲細胞用MGM-448），需通過預(yù)實驗篩選配方：測試細胞增殖速度、貼壁率及形態(tài)穩(wěn)定性，并驗證血清批次適用性。添加生長因子（如bFGF）或抑制劑（如BrdU）時，需定制濃度；無血清培養(yǎng)基適用于特定分泌實驗。

 

    （3）小牛血清：胎牛血清（或優(yōu)質(zhì)新生牛血清）對維持細胞存活及增殖至關(guān)重要，其白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和生長因子是核心功能成分。需預(yù)篩選至少3個批次：通過細胞增殖率（CCK-8法）、貼壁率及無污染檢測（如支原體PCR）綜合評估；選定批次后應(yīng)分裝凍存、避免反復(fù)凍融，并全程用于同一項目。若需切換批次，需交叉培養(yǎng)驗證細胞適應(yīng)性72小時。

 

    （4）膠原酶溶液：膠原酶溶液需新鮮配制，因凍存（含-80℃）會導(dǎo)致酶空間結(jié)構(gòu)解折疊，活性不可逆衰減。若需保存，應(yīng)分裝避光存于-80℃且≤2周。消化時需實時監(jiān)控組織狀態(tài)，延長消化時間將加劇細胞膜損傷與代謝紊亂。

 

    （5）L-谷氨酰胺：幾乎所有細胞對其有高需求，是合成核酸/蛋白質(zhì)的關(guān)鍵底物及能量來源，缺乏會導(dǎo)致生長停滯甚至死亡。但其降解產(chǎn)物氨（NH?）具有強毒性（>2mmol/L即抑制代謝），建議：

 

    單獨分裝后-20℃凍存，避免反復(fù)凍融；

 

    使用前臨時加入培養(yǎng)基；

 

    4℃保存超過7天需補加全量，若培養(yǎng)基變黃（pH>7.6）則廢棄換新液；

 

    對氨敏感細胞（如神經(jīng)元），優(yōu)先選用丙氨酰-谷氨酰胺替代品。

 

    （6）靜置培養(yǎng)：消化分離后的初期（24-72小時）需保持培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，避免物理擾動。但需每日遠程監(jiān)測培養(yǎng)基顏色（pH）、CO?濃度及溫度。若培養(yǎng)基變黃或出現(xiàn)懸浮顆粒，應(yīng)立即終止靜置；對包被依賴性細胞（如神經(jīng)元），靜置前需進行基質(zhì)預(yù)涂布。

 

    （7）消化時間：通常消化至肉眼可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已松散，稍加吹打即可形成細胞團或單個細胞，過長的消化時間往往導(dǎo)致細胞損傷加重，細胞培養(yǎng)成活率降低。

 

    （8）生長因子：經(jīng)消化、貼壁等常規(guī)處理后，原代細胞培養(yǎng)仍需針對性添加生長因子。例如胰島素可增強代謝底物攝??；EGF、bFGF等能促進有絲分裂，但成本較高。特殊類型細胞（如神經(jīng)元、干細胞）還需組合特定因子（如VEGF、KGF）以維持功能。

 

    原代細胞培養(yǎng)的成功，依賴于無菌操作、培養(yǎng)基定制、血清篩選等環(huán)節(jié)的精準協(xié)同調(diào)控。未來需推動無血清培養(yǎng)基降低批次差異，結(jié)合自動化監(jiān)測優(yōu)化消化終點。其核心價值在于構(gòu)建個體化疾病模型及精準藥物篩選平臺，但需同步突破傳代極限并完善倫理規(guī)范。