ELISA是一種酶聯(lián)免疫分析測(cè)定技術(shù)，提供一種檢測(cè)或量化特定分析物濃度的工具。在實(shí)驗(yàn)中，ELISA的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)格式分為96微孔板（通常為8行12列）。每個(gè)微孔都經(jīng)過(guò)預(yù)處理以產(chǎn)生反應(yīng)，在大多數(shù)情況下，反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致微孔中溶液的顏色發(fā)生變化。分光光度計(jì)用于檢測(cè)穿過(guò)該溶液的光量?？讖耐该鳎o(wú)反應(yīng)）變?yōu)樯钏{(lán)色（100%反應(yīng)），顏色變深時(shí)，可通過(guò)分光光度計(jì)記錄的光密度讀數(shù)變化檢測(cè)出來(lái)。將未知分析物的濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)制劑構(gòu)建的。

  ELISA數(shù)據(jù)輸出類型

  ELISA數(shù)據(jù)輸出類型分為3類，這3類分別如下：

  1.定性ELISA：該檢測(cè)提供簡(jiǎn)單的陽(yáng)性或陰性結(jié)果，它只能通過(guò)與沒(méi)有抗原或無(wú)關(guān)對(duì)照抗原的空白孔進(jìn)行比較來(lái)確認(rèn)是否存在任何抗原。

  2.半定量ELISA：該檢測(cè)方法比較被測(cè)樣本中抗原的相對(duì)含量。檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度將直接對(duì)應(yīng)于抗原的含量。但是，由于ELISA試劑盒中不存在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，因此無(wú)法通過(guò)此方法計(jì)算出準(zhǔn)確的濃度。

  3.定量ELISA：該檢測(cè)方法可計(jì)算樣本中抗原的準(zhǔn)確含量。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白通過(guò)一系列連續(xù)稀釋構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中插入未知的抗原濃度，以計(jì)算樣本中抗原的含量。此程序最常用于報(bào)告ELISA數(shù)據(jù)。

  ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

  使用標(biāo)準(zhǔn)或校準(zhǔn)曲線定量計(jì)算待測(cè)樣本中未知抗原的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用標(biāo)準(zhǔn)參考抗原的已知濃度與每個(gè)濃度的光密度（通常使用平板讀數(shù)器在450nm處）繪制的。

  大多數(shù)酶標(biāo)儀通常都配有軟件，可自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和曲線擬合。通過(guò)外推標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分來(lái)計(jì)算未知抗原。紀(jì)寧在這里建議在進(jìn)行ELISA測(cè)定時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行兩次或三次重復(fù)，以確保結(jié)果的良好統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。可以計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)來(lái)評(píng)估移液的精度，最佳實(shí)踐的CV值應(yīng)保持在20%以下。

  此外，建議在ELISA板設(shè)置過(guò)程中加入陽(yáng)性對(duì)照（已知分析物數(shù)量或存在分析物的樣品）和陰性對(duì)照（沒(méi)有分析物數(shù)量或存在的樣品）。

  曲線擬合軟件

  1.半對(duì)數(shù)圖：使用濃度對(duì)微孔板讀數(shù)的對(duì)數(shù)。生成典型的S形曲線，使數(shù)據(jù)點(diǎn)分布更均勻。該方法有助于抵消線性圖導(dǎo)致的下端壓縮。

  2.線性圖：繪制一條曲線，一條軸表示抗原濃度，另一條軸表示微孔板讀數(shù)。大多數(shù)情況下，R2值大于0.99表示曲線擬合良好。值得注意是，線性圖會(huì)壓縮數(shù)據(jù)點(diǎn)，尤其是在曲線的下端，這會(huì)導(dǎo)致分辨率降低。

  3.對(duì)數(shù)/對(duì)數(shù)圖：這在低至中等濃度范圍內(nèi)很常見(jiàn)，因?yàn)樗诖朔秶鷥?nèi)具有良好的線性。但是，如果濃度增加到更高的范圍，則會(huì)發(fā)現(xiàn)線性會(huì)消失。

  4.4PL或5PL曲線（4或5參數(shù)物流）：這些是高度復(fù)雜的程序，需要更復(fù)雜的計(jì)算。4PL方法基于感染點(diǎn)周圍的對(duì)稱性，而5PL方法考慮不對(duì)稱性，對(duì)于大多數(shù)免疫測(cè)定來(lái)說(shuō)，5PL通常更適合。

  峰值恢復(fù)

  加標(biāo)回收有助于確定樣品中是否存在可能干擾抗體與抗原結(jié)合過(guò)程的成分。該過(guò)程通過(guò)使用已知濃度的重組蛋白加標(biāo)樣品基質(zhì)來(lái)執(zhí)行。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)的回收率以百分比表示，通常，低于80%的值表示基質(zhì)中存在干擾測(cè)定的成分。在這種情況下，我們建議使用不同的ELISA試劑盒。

  變異系數(shù)（CV）

  變異系數(shù)對(duì)于確定所獲得的數(shù)據(jù)或結(jié)果中的任何不準(zhǔn)確性或不一致性非常重要。這通常表示為相對(duì)于平均值的方差百分比。方差越大，預(yù)期的不一致或不準(zhǔn)確性就越大。導(dǎo)致變異系數(shù)(CV)過(guò)高的一些常見(jiàn)因素包括樣品污染、溫度變化、移液錯(cuò)誤、清洗不充分和孔變干。

  上述是紀(jì)寧為大家簡(jiǎn)要介紹下ELISA試劑盒數(shù)據(jù)分析的概念。數(shù)據(jù)分析是非常重要的工作，它可以檢驗(yàn)ELISA實(shí)驗(yàn)的成果，了解這些概念可以更有效幫助您做數(shù)據(jù)分析。