科研工作者可以借用ELISA試劑盒分析每個樣本中存在特定抗原或抗體濃度。ELISA原理將待檢測抗原或抗體固定在微孔板上。然后，加入與目標抗原或抗體特異性結(jié)合的檢測抗體。該檢測抗體通常與辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等酶偶聯(lián)。在加入相應的底物后，酶催化底物發(fā)生反應，產(chǎn)生可檢測的顏色變化或發(fā)光信號。通過酶標儀讀取信號強度，可以確定樣本中目標抗原或抗體的濃度。

圖1 elisa原理

  顯色分析

  這是目前最常用的方法，它也叫比色測定，其結(jié)果是產(chǎn)生有色反應終產(chǎn)物，該終產(chǎn)物吸收可見光。已知反應產(chǎn)物的光密度讀數(shù)與被檢測的分析物的量成正比。

  對于此過程，辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)偶聯(lián)抗體通常與顯色底物溶液(3,3′,5,5′四甲基聯(lián)苯胺，TMB)一起使用。TMB被視為一種極其敏感的底物，它可以產(chǎn)生可在650nm波長下測量的藍色。

  對于大多數(shù)比色測定，使用過氧化物酶或磷酸酶就足夠了。這兩種酶都可以與許多不同的底物一起使用，以產(chǎn)生定性或定量的ELISA結(jié)果。另一個重要點是這些底物可以產(chǎn)生有色的可溶性反應產(chǎn)物。這是進行ELISA測試時的想法。

  有許多因素會影響酶活性測量。影響ELISA的一些最常見因素包括溫度、pH條件、反應時間、底物消耗、緩沖液成分、離子強度、酶變性、光照、蛋白質(zhì)抑制劑的積累以及由于產(chǎn)品濃度增加而導致的逆反應增加。對于所有市售試劑盒，所有這些條件和因素都已優(yōu)化，以確保每次都能產(chǎn)生準確的結(jié)果。

  此外，該方法反應速度快，非常適合任何動力學分析。該程序依靠吸光度來確定讀數(shù)，然后可以使用標準曲線確定分析物的未知濃度。

  熒光分析

  這些免疫測定法是顯色測定法的簡單變體。唯一的區(qū)別是HRP或AP偶聯(lián)檢測抗體使用熒光底物而不是比色底物。一般來說，這種方法提供稍高的信號和更寬的動態(tài)范圍。與比色法設定的2.0-4.0OD限值相比，這可以更準確地測量更高的讀數(shù)。這種方法的一個缺點是與比色底物相比，熒光底物的半衰期較短。

  該檢測法的一些特性包括：與比色法相比，靈敏度高100倍，效率高，不使用放射性物質(zhì)，安全且相對容易使用。但是，它會產(chǎn)生背景熒光干擾（可以使用黑色微孔板將其最小化），并且需要熒光計來讀取信號（這是一種相當昂貴的設備）。

  目前市場上有許多不同的熒光計。在選擇特定儀器時，需要考慮的一些特性包括：可調(diào)節(jié)光檢測器、讀數(shù)室內(nèi)的熱一致性、數(shù)值可調(diào)增益、混合和匹配發(fā)射和激發(fā)波長、內(nèi)部背景控制機制、頂部和底部檢測的選擇、選擇每個孔的持續(xù)時間和讀取次數(shù)的選項。

  化學發(fā)光分析

  發(fā)光測定被認為是標準ELISA程序的變體，與熒光免疫測定非常相似。本質(zhì)上，使用酶將底物轉(zhuǎn)化為反應產(chǎn)物，該過程導致以質(zhì)子形式發(fā)光。這種測定中常用的一些酶是HRP和AP。

  發(fā)光過程可以定義為物質(zhì)從電子激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時發(fā)出的光。當激發(fā)中間體返回基態(tài)時會釋放出質(zhì)子。釋放的質(zhì)子可以用可以測量發(fā)光信號的設備來檢測。

  發(fā)光有很多種形式，最常見的是化學發(fā)光、光致發(fā)光和生物發(fā)光。它們之間唯一真正的區(qū)別是達到激發(fā)態(tài)的方式。

  1.化學發(fā)光：光是由于化學反應產(chǎn)生的。

  2.光致發(fā)光：這是一種簡單的熒光過程，激發(fā)是由特定波長的光引起的。

  3.生物發(fā)光：使用具有生物發(fā)光特性的化合物，例如螢火蟲熒光素酶和熒光素。

  ELISA檢測最常用的方法是化學發(fā)光和生物發(fā)光。這些方法具有靈敏度高和動態(tài)重測范圍廣的優(yōu)點。測量的是相對光單位(RLU)，它們往往與樣本中存在的分析物量成正比。

  可以得出結(jié)論，上述每種檢測方法都有各自的要求，但是，通過這三種方法，可以開發(fā)出一種高度靈敏、精確和可重復的檢測方法，從而獲得一般準確的結(jié)果。

  無論使用哪種方法，都有一些需要考慮的共同參數(shù)，例如使用適合所采用的方法和應用的酶標簽、選擇正確的酶和底物、創(chuàng)建優(yōu)化條件，最后使用正確的儀器進行測量。